Bionieuws

Gen & Micro

Crispr-Cas: nu al een onmisbare genetische gereedschapskist

Still uit een 3D-animatie waarbij het Crispr-Cas9-complex (groen) een stuk menselijk dubbelstrengs-dna (wit) op een vooraf bepaalde plaats heeft openknipt. Animatie: Visual Science and Skoltech, www.visual-science.com/crispr

De Crispr-Cas-systemen voor genoomredigeren van eukaryoten zijn vijf jaar geleden ontdekt. De veelzijdige toepassingen blijven ook pionier John van der Oost verbazen. ‘Het zet alles op de kop.’

‘Het is een schitterende gift die we danken aan microben. Want wat voor mooie dingen wetenschappers er ook mee weten te maken, het blijft natuurlijk gebaseerd op iets dat bacteriën en archaea in miljoenen jaren hebben ontwikkeld als afweersysteem tegen virussen’, zegt de Wageningse microbioloog John van der Oost. Hij is organisator van het KNAW-symposium Crispr-Cas – from Evolution to Revolution dat donderdag 8 maart in Wageningen plaatsvindt. Een symposium ter gelegenheid van het 100-jarig bestaan van Wageningen Universiteit, dat ook min of meer samenvalt met het eerste lustrum van genoomredigeren van eukaryoten met Crispr-Cas (eLife en Science, 2013) en het tweede lustrum van de Wageningse ontdekking hoe E. coli-bacteriën hun dna-archief van virusaanvallen gebruiken om met Cas-eiwitten die virussen te herkennen en onschadelijk te maken (Science, 2008).

Doorbraak
‘Achteraf bleek dit een enorme doorbraak’, zegt Van der Oost , ‘want we hadden als eersten belangrijke principes van het Crispr-Cas-systeem opgehelderd: Crispr-rna wordt gebruikt om overeenkomstig dna te herkennen en te knippen. Verder lieten we voor het eerst zien dat het systeem transplanteerbaar is naar andere bacteriën en dat door aanpassing van de Crispr-sequentie dna op elke gewenste positie is aan te vallen. Zonder dat we het ons toen realiseerden was dit toch de basis van de Crispr-revolutie waar we nu in zijn beland.’

3D-animatie van de werking van Crispr-Cas9. Animatie: Visual Science and Skoltech

De revolutionaire ontwikkelingen rond CrisprCas zijn te danken aan een kronkelig wetenschapspad met meerdere mijlpalen van soms toevallige ontdekkingen, compleet verkeerde hypothesen en volhardende onderzoekers die soms met moeite hun bevindingen gepubliceerd kregen. De Amerikaanse geneticus Eric Lander beschreef deze historie kort en krachtig in het Cell-perspective The Heroes of Crispr van 2016 (zie onder: Tijdlijn Crispr-Cas en The Scientist, 2016). De belangrijkste les is volgens hem dat medische doorbraken vaak ontstaan vanuit een compleet onvoorspelbaar startpunt. ‘De vroege helden van Crispr waren niet op zoek naar een systeem voor het redigeren van menselijke genomen – ze onderzochten zelfs geen menselijke ziekte. Hun motieven waren een mix van persoonlijke nieuwsgierigheid (om bizarre repeterende sequenties in microben beter te begrijpen), militaire noodzaak (om bescherming tegen biologische oorlogsvoering te ontwikkelen) en industriële toepassing (om de yoghurtproductie te verbeteren)’, schrijft Lander.

Verscheidenheid
Van der Oost werd in 2005 in het toen nog obscure veld van Crispr-systemen geïntroduceerd door de Russisch-Amerikaanse evolutie- en genoombioloog Eugene Koonin, die 9 maart in Wageningen een eredoctoraat krijgt voor het classificeren en analyseren van Crispr-Cas-systemen. ‘De verscheidenheid van bijvoorbeeld Crispr-geassocieerde Cas-genen en de corresponderende Cas-eiwitten is enorm. Ze werken allemaal net iets anders en er duiken nog steeds nieuwe varianten op. Niet zo verwonderlijk als je weet dat Crispr-Cas-systemen aanwezig zijn in ongeveer de helft van alle bacteriën en archaea. In de basis is het een archiveringssysteem, waarbij de microben in hun eigen dna keurig genetische informatie opslaan van de virusaanvallen die ze hebben doorstaan. Het lijkt wel een beetje op een lade-archief: de recent toegevoegde dossiers zijn het meest accuraat, maar als je naar het verleden loopt, zie je dat het wat rommeliger wordt. Niet zo vreemd, want zo’n virus evolueert natuurlijk ook gewoon door’, legt Van der Oost uit.

'Het lijkt op een lade-archief:
als je naar het verleden loopt,
zie je dat het wat rommeliger wordt'


De korte stukjes virus-dna in het dossier (spacers) worden steeds afgewisseld met een vast motief in sequenties (repeats). Samen werken zulke Crispr’s – Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – als het genetisch geheugen van eerdere virusaanvallen. Als een bacterie of archaeon opnieuw wordt geïnfecteerd door een virus die voorkomt in het virale dna-archief, komt het Crispr-Cas-systeem in actie. Met uit het archief afgelezen rna gaat het complex op zoek naar complementaire dna-patronen. Is er een match, dan zorgen de Cas-eiwitten dat het virus-dna in kleine stukjes wordt opgebroken en het virus het loodje legt. Van der Oost: ‘Er is zelfs nog een controlemoment. Het knippen gaat pas van start als er een PAM-motief aanwezig is, een check om te voorkomen dat microben hun eigen dna-archief vernietigen. Heel vernuftig.’

Aangrijpingspunten
Inmiddels begint er een beetje orde te komen in de naamgeving van de Cas-eiwitten, door ze in te delen in klassen en typen. ‘Het meest bekende Crispr-nuclease is Cas9. Een alternatief is het Cpf1-eiwit, ontdekt door Koonin en mede door mijn groep gekarakteriseerd. Het werkt anders dan Cas9 omdat het maar één rna nodig heeft om dna te knippen, andere PAM-motieven herkent en min of meer in spiegelbeeld werkt’, legt Van der Oost uit. Met in zijn hand een 3D-geprint model van Cpf1 legt hij uit dat vorm en aangrijpingspunten voor een belangrijk deel bepalend zijn voor wat een specifiek Crispr-Cas-systeem allemaal kan. Inmiddels zijn er systemen ontdekt die alleen op rna aangrijpen, en gemodificeerde systemen die alleen nog maar aan het dna binden – zonder het te knippen – om dat vervolgens op allerlei manieren (epi)genetisch te manipuleren. ‘Je kunt het zo gek niet verzinnen of er is wel een Crispr-Cas-systeem dat het kan. Qua genetische modificatie zet het alles op zijn kop’, aldus Van der Oost. De vele toepassingsmogelijkheden van Crispr-Cas blijven iedereen dagelijks verbazen.

Met de op Crispr-Cas-technologie gebaseerde Sherlock-test is snel en eenvoudig een dengue- of zika-infectie vast te stellen. Foto: Zhang lab, Broad Institute of MIT & Harvard

Zo presenteren Amerikaanse onderzoekers op 16 februari in Science drie op Crispr-enzymen gebaseerde detectiesystemen – Camera, Detectr en Sherlock – voor het registreren van celdata en het vaststellen van infecties van mensen met papilloma-, zika- of dengue-virussen. Ook de Groningse hoogleraar moleculaire epigenetica Marianne Rots roemt de gereedschapskist die dankzij Crispr-Cas binnen het bereik is gekomen van biomedische wetenschappers. ‘Het is nu al onmisbaar en eigenlijk niet meer weg te denken. Het werkt simpel en snel, je bestelt gewoon een specifiek stukje dna, maakt een gewenst construct en je hebt al binnen een paar weken resultaat. Het bijzondere van Crispr-Cas is dat je ook multiplex kunt werken, dus meerdere genen tegelijk kunt aanpakken en de meeste ziekten zijn nu eenmaal gebaseerd op meerdere genen’, aldus Rots.

Biohackers
Juist in de eenvoud – waardoor ook biohackers de Crispr-Cas-techniek massaal omarmen – ziet Rots ook een mogelijk valkuil. ‘De meeste laboratoria bezitten genoeg kennis en controlemechanismen om verantwoord te werk te gaan, maar ik vrees dat dat niet geldt voor alle garages waarin biohackers actief zijn. Ik hoop echt dat het niet leidt tot ongelukken of uitwassen waardoor de Crispr-Cas-techniek in een slecht daglicht komt te staan. Dit geldt natuurlijk ook voor de nu al geïnitieerde klinische Crispr-studies: want bij op virussen gebaseerde gentherapie hebben we gezien dat een vakgebied door incidenten jaren achterop kan raken. We hebben nu de mogelijkheid dna naar onze wensen te herschrijven, laten we dat in vredesnaam op een zorgvuldige en zo veilig mogelijke manier doen.’


Er zijn vele Crispr-Cas-systemen, maar de bekendste en tot nu toe meest gebruikte technologie voor genoomredigeren is gebaseerd op Crispr-Cas9. Het Cas9-eiwit is de nuclease die het te modificeren dubbelstrengs-dna kan openknippen. Dit eiwit is gekoppeld aan een Crispr-rna-gids, die de nuclease leidt naar de specifieke plaats waar het dna geknipt moet worden. In het geval van een single guide-rna (sg-rna) bestaat deze uit twee componenten – Crispr-rna (cr-rna) en trans-activating Crispr-rna (tracr-rna) – die één streng vormen met aan het uiteinde een haarspeldbocht voor binding. De eerste twintig nucleotiden van het gids-rna zorgen door hun complementaire sequentie voor herkenning van het doel-dna. Het Cas9-eiwit knipt vervolgens uitsluitend als er direct naastliggend een zogeheten PAM-sequentie – Protospacer Adjacent Motif – van twee tot zes baseparen wordt herkend. Dit is gebruikelijk het NGG-motief, een willekeurige nucleotide (N) gevolgd door twee guanines (G’s). Hiermee dient dus rekening te worden gehouden bij de constructie van het gids-rna. De dubbele strengen worden opengeritst en in dit geval twee nucleasedomeinen (blauwe schaartjes) – RuvC en HNH – zorgen voor breuken in de twee dna-strengen. Zo is het mogelijk een gen uit te schakelen of een gewenst genconstruct in de vorm van donor-dna in te brengen (onderste deel illustratie). Na de gebruikelijke reparatiemechanismen blijft uiteindelijk geredigeerd, nieuw dna achter.


Tijdlijn met sleutelontdekkingen rond Crispr-Cas

1987 - Japanse onderzoekers ontdekken rare palindrome-nucleotidesequenties in E. coli (Journal of Bacteriology, 1987).

1993 - De Spaanse microbioloog Francisco Mojica vindt Short regulary spaced repeats (Srsr) in de archaea Haloferax mediterranei en H. volcanii ( Molecular Microbiology, 1993).

2002 - De Utrechtse bioinformaticus Ruud Jansen hernoemt dna-herhalingen in prokaryoten Clustered Regulary Interspaced Palindromic Repeats (Crispr) (Molecular Microbiology, 2002).

2003 - Mojica ontdekt associaties tussen Crispr’s en virus-dna en veronderstelt dat ze onderdeel zijn van een adaptief immuunsysteem in microben. (Journal of Molecular Evolution, 2005).

2006 - Franse en Canadese onderzoeksgroepen tonen experimenteel aan dat Streptococcus thermophilus virusresistentie verkrijgt dankzij specifieke Crispr’s en rapporteren de vondst van een groot eiwit met nuclease-activiteit (nu: Cas9) en van een vast sequentiepatroon voor herkenning (nu: PAM) (Science, 2007).
De Russisch-Amerikaanse evolutie- en genoombioloog Eugene Koonin ontwikkelt een hypothetisch schema voor de werking van Crispr’s (Biology Direct, 2006).

2008 - De Wageningse microbiologen John van der Oost en Stan Brouns karakteriseren vijf Cas-eiwitten – het Cascade-complex – en het Cas3-gen in E. coli die samen zorgen voor het knippen van rna dat is overgeschreven uit het Crispr-archief en vervolgens waarschijnlijk het bijpassende virus-dna uitschakelen. Ook tonen ze voor het eerst aan dat met design-Crispr heel specifiek elk gewenst dna kan worden aangevallen (Science, 2008 en Bionieuws 14, 2008).
Onderzoekers uit Chicago bevestigen dat Crispr een programmeerbaar restrictie-enzym is dat zich richt op dna en voorspellen de bruikbaarheid voor genoomredigeren (hun patentaanvraag strandt op te weinig experimentele onderbouwing) (Science, 2008) .

2010 - Canadese onderzoekers tonen aan dat Cas9-nucleases dubbelstrengs dna knippen, precies op de plek waar de sequenties overeenkomen met het Crispr-rna (Nature, 2010).
Terwijl Franse en Duitse onderzoekers de essentiële rol van trans-activating Crispr-rna (tracr-rna) ophelderen (Nature, 2011) .
Onderzoekers in Litouwen brengen het Crisprsysteem van Streptococcus thermophilus volledig werkzaam over in E. coli (Nucleic Acids Research, 2011) .

2012 - De Franse Emmanuele Charpentier en de Amerikaanse Jennifer Doudna koppelen het CrisprCas9-systeem van Streptococcus pyogenes aan gids-rna (sg-rna), waardoor het bruikbaar is voor rna-geprogrammeerd genoomredigeren (Science, 2012) .

2013 - De Harvard microbioloog Feng Zheng presenteert een werkbaar systeem voor genoomredigeren van zoogdiercellen met Crispr-Cas9 (Science, 2013 en Bionieuws 2, 2013).
Het redigeren met Crispr-Cas verspreidt zich viraal in onderzoekswereld: met gemeld succes in gisten, nematoden, fruitvliegen, zebravissen, muizen en apen (review Cell, 2014) .

2015 - Chinese onderzoekers corrigeren een mutatie in humane embryocellen met Crispr-Cas-technologie (Nature, 2015), in Washington vindt de International Summit on Human Gene Editing plaats, tijdschrift Science benoemt de technologie tot Breakthrough of the Year (Science, 2015) en Bionieuws constateert een opleving van de gentherapieën (Bionieuws 19, 2015) .

2016 - In China vindt de eerste klinische toepassing van Crispr-Cas plaats op een patiënt met agressieve longkanker (Nature, 2016).
Ook de Amerikaanse National Institutes of Health krijgen groen licht voor de eerste klinische studie met Crispr-Cas9 voor kankertherapieën met T-cellen (Nature, 2016).
Crispr-pionier Jennifer Doudna neemt in Nederland de Heinekenprijs in ontvangst (Bionieuws 14, 2016).

2017 - Het Broad Institute wint namens Harvard University en Massachusetts Institute of Technology de eerste slag in de patentstrijd met University of California, Berkeley, doordat patentrechters een interferentieclaim afwijzen (Nature, 2017)

Dit artikel verscheen in Bionieuws 4 van 24 februari 2018.